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熒光實時定量PCR

QPCR



實驗原理


實時熒光定量PCR技術(Real-time Quantitative PCR,qPCR)是指在PCR反應體系中加入可與DNA產物特異性結合的熒光基團,利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程,最終通過相對定量或絕對定量的方法確定各個樣本的本底表達量。qPCR所使用的熒光化學試劑可分為兩種:熒光染料和熒光探針。


熒光染料SYBR Green:嵌入到雙鏈DNA分子后構象發生變化,能夠吸收497nm的激發光并發出520nm的熒光;而不摻入DNA雙鏈中的染料分子不會發射任何熒光信號,從而保證熒光信號的增加與PCR產物的增加完全同步,見圖 4.1。


4.1.jpg

圖 4.1 SYBR Green 熒光染料法qPCR檢測原理圖


TaqMan 熒光探針:擴增時加入一個特異性的寡核苷酸熒光探針,兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。探針完整時,報告基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收;PCR擴增時,Taq 酶的 5'-3' 外切酶活性將探針酶切降解,使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離,從而熒光監測系統可接收到熒光信號,實現了熒光信號的累積與PCR產物形成完全同步,見圖 4.2。

4.2.jpg

圖 4.2 TaqMan 熒光探針法qPCR 檢測原理圖


SYBR GREEN 法和 TaqMan 探針法的區別


方法

優點

缺點

應用

SYBR GREEN

方便快捷,不必針對各個基因設計合成TaqMan探針,具有價格優勢。

無模板特異性,對引物特異性要求較高,需進行熔解曲線分析;靈敏度相對較低。

應用于基因的差異表達分析,比RNA干擾效果確認。

TaqMan 探針法

熒光化合物標記到特異性的寡核苷酸上,具有高度特異性,重復性好,熒光信號強。

只適合一個特定的目標,探針價格較高。

通常應用于基因拷貝數的確定,在臨床診斷中最常用,比如病毒和病原菌定量檢測。


技術應用


定量方法

原理

技術應用

絕對定量

(Absolute Quantification,AQ)

是測定目的基因在樣本中的分子數目,即通常所說的拷貝數。

病原體檢測;

轉基因食品檢測;

基因表達研究。

相對定量

(Relative Quantification,RQ)

測定目的基因在兩個或多個樣本中的含量的相對比例,而不需要知道它們在每個樣本中的拷貝數。

基因在不同組織中的表達差異;藥物療效考核;耐藥性研究。



實驗流程


流程.jpg



實物

數據信息

實驗周期

客戶提供

樣本

靶基因NCBI登錄號

4

我們提供

基本實驗步驟、EXCEL原始數據擴增線,溶解曲線


實驗結果展示


1)目的基因          

 

目的基因.jpg

                                                   

2)內參基因

內參基因.jpg


3)柱形圖

柱形圖.jpg

圖 4.3  A、B 兩種細胞經加藥處理后目的基因在各個時間點的qPCR相對定量表達量檢測

1)目的基因的擴增曲線與熔解曲線;2)內參基因的擴增曲線與熔解曲線 ;

3)目的基因在 A、B 兩種細胞加藥處理后各個時間點的表達量柱形圖(2-ΔΔCt相對定量數據處理)。


擴增曲線和溶解曲線的常見術語:


基線

Baseline

PCR擴增反應的最初數個循環里,熒光信號變化不大,接近一條直線,即稱為基線。

熒光域值

Threshold Value

一般將PCR反應前15個循環的熒光信號作為熒光本底信號,熒光域值3-15個循環熒光信號標準差的10 倍,熒光域值設定在PCR擴增的指數期。

Ct

Threshold Cycle

擴增產物的熒光信號進入指數增長期時所經歷的循環數。模板的Ct與起始拷貝數的對數存在線性關系,起始拷貝數越多,Ct 值越小。

熔解曲線Tm

Tm Of Melting Curve

SYBR Green染料發實驗結束后需對qPCR產物加熱,隨著溫度的升高,雙鏈接擴增產物逐漸解鏈,導致熒光強度下降,到達某一溫度時,會導致大量的產物解鏈,熒光急劇下降,將此溫度稱為Tm值。不同PCR產物Tm值不同,從而可對PCR的特異性進行鑒定。


TROUBLESHOOTING


實驗問題

原因

推薦解決方法

Ct 值起跳過晚

引物設計不佳

重新設計引物,RT—PCR摸索好擴增條件。

擴增效率低

降低退火溫度,適當提高鎂離子濃度;PCR產物長度控制在100bp 左右;熒光染料未降解。

模版量低

增加反應循環數,提高模版量。

Ct 值起跳

引物設計不佳

重新設計引物,RT—PCR摸索好擴增條件。

模板量低

增加反應循環數,提高模板量。

熔解曲線出現雙峰?

非特異性擴增條帶

優化PCR反應條件,如提高退火溫度,降低鎂離子濃度;若優化失敗需重新設計引物。

引物二聚體

降低引物濃度或重新設計引物。

基因組污染

抽提獲得的RNADNase I消化基因組DNA后進行后續實驗。


常見問題FAQ


Q:qPCR與普通PCR的區別是什么?

名稱

特點

普通PCR

PCR反應結束后對終點產物進行電泳定量分析,誤差較大。

qPCR

實時檢測PCR擴增過程,在擴增的指數期對起始模板量進行定量分析,重復性好,誤差小。


Q:請問進行相對定量檢測前提供組織樣本時需要將組織塊定量嗎?

A:不需要,采用qPCR相對定量法主要是以表達量穩定的內參基因作為對照從而判斷目的基因相對表達豐度。我們在實驗操作中會對各個環節進行把控,確保實驗結果的客觀性:1)組織抽提的RNA會進行定量;2)正式上機前對樣本進行RT-PCR檢測確定反應條件;3)上機檢測后的相對定量數據分析,計算每個樣本目的基因對相對穩定的內參基因的表達差異,可以排除上樣量的差別對數據分析的影響。


Q:可以進行miRNA的熒光定量PCR檢測服務嗎?與編碼基因的qPCR操作流程上有何區別?  

A:可以,采用專用的miRNA熒光定量PCR試劑盒即可。與編碼基因的qPCR檢測流程上的主要區別是需要將提取后的RNA,用poly(A) 聚合酶在其3’末端加尾,再用5’端帶40nt延伸序列的單堿基錨定Oligo-dT引物進行反轉錄,得到約80ntcDNA,然后用特異引物進行SYBR   Green實時定量PCR擴增。其中miRNA的引物設計需要大量摸索,才能獲得重復性高可信度高的數據。


Q:如何制備絕對定量 PCR 的標準品?

A:將欲定量基因的一小段序列(200-300bp)克隆到T載體上,經測序驗證后,進行小量抽提,采用分光光度計定量,按照公式計算拷貝數后梯度稀釋,用于上機繪制標準曲線,從而計算待檢測基因的拷貝數多少。


Q:熒光定量PCR有哪些注意要點?

A:熒光定量PCR的關鍵步驟在于RNA的抽提和引物的設計。RNA的抽提需要嚴格進行RNase

free的操作,抽提的RNAOD260/OD280需嚴格控制在1.9-2.1之間。引物設計主要的考慮是其PCR反應特異性好和擴增效率高,進行PCR反應時無非特異性的條帶和引物聚合體出現,盡量選取GC含量在40-60%的區段進行擴增。另外,還需要適應熒光定量PCR儀上機條件的設定,退火溫度在55-65° C之間。除此之外,其他各個環節如試劑的穩定性,RNA反轉的質量好壞,PCR上機條件的設定,加樣的手法和熟練度等等也要注意。


Q:熒光定量PCR引物的設計原則是什么?

A:1)擴增產物長度在80-200bp;引物應在核酸序列保守區內設計并有特異性;引物通常設計為跨內含子。

2)產物不能形成二級結構;引物長度在18-30bp之間,其中堿基應隨機分布;待擴增的片段Tm值應在55-65°C之間;待擴增的片段GC含量在40-60%之間;引物自身及引物之間不能有連續4個堿基的互補。

3)引物5′端可進行修飾,3′端不能進行修飾; 引物3′端要避開密碼子的第3位。


Q:如何設計熒光定量PCR的TaqMan探針?

A:TaqMan探針的設計原則為盡量靠近上游引物;長度一般為30-45bp,Tm 值至少比擴增引物高 5° C;5′端不能為 G,因為 G 會淬滅熒光,從而影響定量;設計時,需要通過軟件來進行設計,網絡上有許多免費的以及在線的設計軟件可以使用。


Q:可否設計羊源、豬源等其他物種基因的qPCR引物?

A:可以設計,但對于人,大鼠,小鼠常規模式生物以外的基因(由于無法在NCBI獲得完整的基因序列信息),在進行PCR優化的時候難度遠遠大于常規生物基因,周期會增加,且可能需設計多對引物才可能獲得滿意的實驗結果。


Q:判斷擴增曲線是否良好的指標有哪些?

A:1)曲線拐點清楚,特別是低濃度樣本指數期明顯。

2)曲線指數期斜率與擴增率成正比,斜率越大擴增效率越高。

3)標準的基線平直或者略微下降,無明顯的上揚趨勢。

4)各管的擴增曲線平行性好,表明各反應管的擴增效率相近。


參考文獻

  1. Livak KJ, Schmittgen TD.  Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods 2001,25:402–408.

  2. Michael A. Innis,David H. Gelfand,John J. Sninsky. PCR Applications: Protocols for Functional Genomics. Academic.

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