逆战的歌曲有哪些:
銳賽生物

靶標發現與功能驗證基因操作和基因組編輯藥物靶標開發生化/細胞水平驗證高通量高內涵分析GPCR/核受體檢測激酶檢測體外藥理學體外安全性評價藥代動力學毒理學評價藥代動力學/毒理學抗腫瘤藥理評價代謝類和心腦血管疾病藥理評價中樞神經系統藥理評價炎癥/自身免疫疾病藥理評價體內藥理學立項成果展示腫瘤個性化治療項目QPCRWB檢測ELISA檢測甲基化檢測SNP檢測高效液相色譜法(HPLC)蛋白質譜基因芯片核酸、蛋白分析服務目的基因的ORF克隆化學合成質粒載體構建siRNA的細胞轉染及篩選技術服務shRNA載體構建及篩選技術服務RNAi病毒包裝及篩選技術服務miRNA的表達載體構建及病毒包裝載體構建及篩選服務chipchip-seqIPCO-IPRNA免疫共沉淀(RIP)RNA pull down免疫共沉淀實驗服務慢病毒包裝腺病毒包裝細胞培養原代細胞分離干細胞誘導分化CCK-8檢測流式周期檢測流式凋亡檢測流式分選細胞流式鑒定細胞表面抗體活性氧(ROS)檢測線粒體膜電位檢測transwell檢測管腔形成實驗細胞黏附實驗細胞克隆形成實驗細胞免疫熒光檢測穩轉株構建雙熒光素酶檢測細胞干性成球能力磁珠分選細胞MDA(丙二醛)檢測酶活動力學檢測HDA檢測細胞實驗服務常規化學染色免疫組化(IHC)免疫熒光(IF)原位雜交(ISH)熒光原位雜交(FISH)原位末端標記染色(TUNEL)組織樣本處理拍照處理病理學檢測服務裸鼠皮下成瘤(CDX模型)人源腫瘤移植模型(PDX模型)糖尿病/肥胖模型心血管類疾病模型腎臟疾病模型肝臟疾病模型炎癥與自身免疫疾病模型呼吸系統疾病模型其他疾病模型動物實驗服務2019精品SCI2018精品SCI2017精品SCI往年精品SCI案例庫漂亮SCI案例庫科研轉化成果u.cad癌癥篩查檢測全外顯子組基因檢測其他疾病基因檢測生物信息數據分析服務腫瘤學領域研究平臺病理學中心實驗室心血管與代謝領域疾病研究平臺炎癥與自身免疫疾病領域研究平臺特發肺纖維化疾病領域研究平臺抗體藥物一體化臨床前研發平臺藥性評價平臺公司新聞價值金字塔三元悖論為客戶贏得榮譽誠覓英才內部推薦加入我們留言板聯系我們推薦朋友SCI論文發表獎勵制度科研資助POLOdeliverer3000CCK-8Annexin V-FITCAnnexin V-RFPECL 發光液細胞周期與凋亡檢測自研試劑基因質粒病毒免費送細胞庫動物飼料促銷活動

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動物實驗、載體構建、細胞實驗、病理學檢測、免疫沉淀、核酸蛋白分析

聯系電話:

021-80158420

質粒載體構建

vector construction



實驗原理


質粒載體可以有效地運載外源基因片段進入受體細胞,可以獨立自主大量復制并且很容易從宿主細胞中分離純化,因而在分子生物學使用十分廣泛。常用的載體可分為克隆載體和表達載體,根據載體進入受體細胞的不同,分為原核細胞表達載體、真核細胞表達載體以及穿梭載體。


技術應用


目的基因的表達研究

基因、蛋白的功能研究


實驗流程




實物

數據信息

實驗周期

客戶提供

非常用的質粒載體

目的基因NCBI登錄號、載體圖譜

3周

我們提供

質粒/菌株

基本實驗步驟、電泳圖片、測序報告


實驗結果展示


A                                                            B

    圖1 目的基因的載體構建電泳圖

A:目的片段的菌落PCR鑒定結果(泳道1-5:1-5號克隆的菌落PCR鑒定結果,其中1-3號樣本為菌落PCR陽性樣本,4-5號樣本為菌落PCR陰性樣本;泳道6:陽性對照;泳道7:陰性對照)。

B:目的片段的酶切電泳結果(目的片段的酶切電泳結果,載體片段5300bp,目的片段820bp)。


TROUBLESHOOTlNG


實驗問題

原因

推薦解決方法

連接轉化后平板上全部為陰性克???

連接效率

優化目的片段與載體片段的比例,載體片段的摩爾數過高導致陰性克隆增多。

連接轉化后平板上無克???

感受態度細胞效率不高

重新制備新鮮的感受態細胞或購買商品化的感受細胞。

連接體系

增加目的片段與載體片段的摩爾數。

收到的質粒轉染效率很低?

質粒純度

提供的10ug小抽質粒適用于分子生物學實驗,其純度及濃度都不適合用于細胞轉染,需客戶進行高純度的質粒抽提工作。

細胞難轉染

在保證細胞狀態良好的條件下,摸索合適的轉染試劑以及轉染條件。

過表達質粒成功轉染后WB未見明顯表達?

蛋白功能

過量表達的蛋白對宿主細胞可能有毒性作用。



常見問題 FAQ


Q:如何看懂一個載體的質粒圖譜?

A1)首先明確載體的功能是克隆載體還是表達載體,表達載體含有啟動子、終止等序列,原核表達載體常用T7啟動子、真核表達載體載體常用CMV啟動子。2)明確多克隆位點(MCS)有哪些酶切位點可用,插在該區域的外源基因可以像載體中的正常序列一樣進行復制和擴增。3)方便的篩選標記,原核抗性如氨、卡那,真核抗性如新霉素、嘌呤霉素。4)有哪些熒光標記或蛋白標簽序列。5)注意是否有其他功能元件。


Q :方便追蹤目標基因表達的GFP的常見真核表達載體有哪幾種,各有說明區別?

A可以提供pEGFP-C1和pIES2-EGFP三種載體選擇(EGFP中E代表Enhanced即經過改造的GFP,熒光強度得到加強,表達效率更高)。前兩種為EGFP的融合表達載體,分別在目的基因的N端和C端進行融合表達,后一種為目的基因與EGFP共表達的載體。


Q :酶切連接有哪些種類?

酶切連接分類

要求

連接結果

粘性末端連接

雙酶切連接

對酶切片段切膠回收

外原片段可定向插入,陽性克隆率高

單酶切連接

載體線性化后需磷酸酶脫磷出來

外源片段會以正反兩個方向插入載體,可能出現串聯拷貝

平末端連接

采用高濃度的連接酶,注意載體和目標片段的比例,可加入PEG4000等凝聚劑

可能出現串聯拷貝,連接效率低,注意增加連接酶量和連接時間


Q:plRES2-EGFP載體中的IRES序列的作用是什么?

AIRES序列的全稱是內部核糖體進入位點序列(Internal Ribosome Entry Site),一般真核mRNA的翻譯都需要5‘帽子來介導核糖體結合。微小RNA病毒家族則外例外,這類病毒在其mRNA前沒有帽子位點,但卻有600-1200bp的5‘非翻譯區,其中含有多個非起始AUG,這段長的非翻譯區即叫做IRES序列。IRES能招募核糖體對mRNA進行翻譯。在同一啟動子下,將目的基因(注意要加終止子后加IRES及EGFP序列,IRES后的EGFP就能獨立地起始翻譯,可與目的基因共表達的作用,但表達量要低于目的基因,GFP熒光劑有可能會較弱。


Q:重組克隆的篩選鑒定方法有哪些?

鑒定名稱

具體方案

抗性篩選

采用含氨芐、卡那抗性的平板或培養基培養

菌落PCR

以少量菌液作為模板采用特定引物擴增檢測是否能夠擴增到目標片段

酶切鑒定

電池判斷酶切獲得目的的片段大小

測序鑒定

確定序列中每一個堿基與預期一致


參考文獻

1. J e a n Pe c c o u d. G e n e  S y n t h e s i s: M e t h o d s and Protocols. Humana Press,2012.

2. Benjamin Lewin. Genes IX [M]. Pearson Education,2007.

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