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靶標發現與功能驗證基因操作和基因組編輯藥物靶標開發生化/細胞水平驗證高通量高內涵分析GPCR/核受體檢測激酶檢測體外藥理學體外安全性評價藥代動力學毒理學評價藥代動力學/毒理學抗腫瘤藥理評價代謝類和心腦血管疾病藥理評價中樞神經系統藥理評價炎癥/自身免疫疾病藥理評價體內藥理學立項成果展示腫瘤個性化治療項目QPCRWB檢測ELISA檢測甲基化檢測SNP檢測高效液相色譜法(HPLC)蛋白質譜基因芯片核酸、蛋白分析服務目的基因的ORF克隆化學合成質粒載體構建siRNA的細胞轉染及篩選技術服務shRNA載體構建及篩選技術服務RNAi病毒包裝及篩選技術服務miRNA的表達載體構建及病毒包裝載體構建及篩選服務chipchip-seqIPCO-IPRNA免疫共沉淀(RIP)RNA pull down免疫共沉淀實驗服務慢病毒包裝腺病毒包裝細胞培養原代細胞分離干細胞誘導分化CCK-8檢測流式周期檢測流式凋亡檢測流式分選細胞流式鑒定細胞表面抗體活性氧(ROS)檢測線粒體膜電位檢測transwell檢測管腔形成實驗細胞黏附實驗細胞克隆形成實驗細胞免疫熒光檢測穩轉株構建雙熒光素酶檢測細胞干性成球能力磁珠分選細胞MDA(丙二醛)檢測酶活動力學檢測HDA檢測細胞實驗服務常規化學染色免疫組化(IHC)免疫熒光(IF)原位雜交(ISH)熒光原位雜交(FISH)原位末端標記染色(TUNEL)組織樣本處理拍照處理病理學檢測服務裸鼠皮下成瘤(CDX模型)人源腫瘤移植模型(PDX模型)糖尿病/肥胖模型心血管類疾病模型腎臟疾病模型肝臟疾病模型炎癥與自身免疫疾病模型呼吸系統疾病模型其他疾病模型動物實驗服務2019精品SCI2018精品SCI2017精品SCI往年精品SCI案例庫漂亮SCI案例庫科研轉化成果u.cad癌癥篩查檢測全外顯子組基因檢測其他疾病基因檢測生物信息數據分析服務腫瘤學領域研究平臺病理學中心實驗室心血管與代謝領域疾病研究平臺炎癥與自身免疫疾病領域研究平臺特發肺纖維化疾病領域研究平臺抗體藥物一體化臨床前研發平臺藥性評價平臺公司新聞價值金字塔三元悖論為客戶贏得榮譽誠覓英才內部推薦加入我們留言板聯系我們推薦朋友SCI論文發表獎勵制度科研資助POLOdeliverer3000CCK-8Annexin V-FITCAnnexin V-RFPECL 發光液細胞周期與凋亡檢測自研試劑基因質粒病毒免費送細胞庫動物飼料促銷活動

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動物實驗、載體構建、細胞實驗、病理學檢測、免疫沉淀、核酸蛋白分析

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酶聯免疫吸附測定

ELISA



實驗原理


酶聯免疫吸附劑測定(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA),是以免疫學反應為基礎,將抗原、抗體的特異性反應與酶對底物的高效催化作用相結合起來的一種敏感性很高的實驗技術?;駒硎牽?)使抗原或抗體結合到某種固相載體表面,并保持其免疫活性。2)使抗原或抗體與某種酶連接成酶標抗原或抗體,這種酶標抗原或抗體既保留其免疫活性,又保留酶的活性。由于酶的催化頻率很高,故可放大反應效果,從而使測定方法達到很高的敏感度。


在測定時,把受檢標本(測定其中的抗體或抗原)和酶標抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應,再用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與其他物質分開,最后結合在固相載體上的酶量與標本中受檢物質的量成一定的比例。加入酶反應底物后,底物被酶催化為有色產物,產物的量與標本中受檢物質的量直接相關,故可根據反應后顏色的深淺進行定性或定量分析(見圖4.7)。


圖4.7 ELISA檢測原理示意圖


實驗流程


E流程.jpg



實物

數據信息

實驗周期

客戶提供

樣本、ELISA試劑盒

ELISA試劑盒說明書

2周及以上

我們提供

剩余試劑盒

基本實驗步驟、EXCEL原始數據、標準曲線



實驗結果展示


結果.jpgConecntrations

圖4.8ELISA標準曲線


表4.1五組樣本目的蛋白ELISA吸光度值及濃度



OD1

OD2

OD3

平均值

C(pg/ml)

1

0.761

0.763

0.762

0.762

136.80

2

0.631

0.633

0.635

0.663

130.71

3

0.704

0.702

0.701

0.702

144.11

4

0.903

0.904

0.901

0.903

144.17

5

0.623

0.618

0.621

0.621

117.45



TROUBLESHOOTING


實驗問題

原因

推薦解決方法

實驗重復性不佳?

操作重復性不佳

同一人員重復操作,注意將樣本充分混勻,保證加樣量一致,其他操作過程如孵育時間,洗板條件保持一致。

加樣孔顯色過深?

洗滌不充分

充分洗滌,徹底拍干。

加樣時間過長

合理安排工作量,樣本量多要控制好加樣速度或分批操作。

孵育溫度過高

采用合適的溫度。

孵育時間過長

注意減少孵育時間。

加樣孔顯色過淺?

試劑盒未充分平衡

4℃冰箱取出試劑盒后于室溫平衡至20分鐘

洗板時沖擊力太大

注意調整洗滌時間和洗滌次數。

底物作用時間不足

注意準確定時。

樣本濃度稀釋過大

預實驗摸索樣本稀釋濃度。

加樣孔包括標準品加樣孔都未顯色?

顯色液過期

更換新的ELISA試劑盒

使用錯誤的試劑

漏加酶結合物或者錯誤的使用終止液提前終止了反應。



常見問題FAQ


Q:ELISA 試 劑 盒 主 要 有 哪 些 試 劑 ?

A:ELISA 試劑盒中主要有

1)已包被抗原或抗體的固相載體(免疫吸附劑);

2)酶標記的抗原或抗體(結合物);

3)酶的底物;

4)標準品;

5)結合物及標本的稀釋液;

6)洗滌液;

7)酶反應終止液。

Q:造成ELISA實驗結果不正常的因素有哪些?

A:造成ELISA測定結果不正常的因素主要有:

1標本因素:樣本需新鮮采集,防止污染,且準確稀釋至適當的倍數。

2)試劑因素:ELISA試劑盒在保質期內,其他試劑如蒸餾水的水質等。

3)操作因素:注意操作細節,如加樣不可太快,避免加在孔壁上;洗板過程中注意洗液不能溢出孔外;顯色要注意控制時間等。


Q:如何準備需要進行ELISA檢測的細胞樣本?

A:檢測細胞分泌性成份時:用無菌管收集細胞培養上清,離心20分鐘(2000-3000轉/ 分)

取上清檢測。檢測細胞內成份時:收集細胞,用PBS(pH7.2-7.4)稀釋細胞濃度至 106/ml左右,通過反復凍融或加入組織蛋白萃取試劑,使細胞破壞并放出細胞內成份。離心 20 分鐘(2000-3000 轉 / 分),收集上清。保存過程中如有沉淀形成,需再次離心。


Q:ELISA 試劑盒(96 孔規格)一般可以進行多少個樣本的檢測?

A:標準品孔和待測樣本孔需進行復孔操作以保證數據的可信度。每次需將標準品按照7-8個梯度稀釋以制備準確的標準曲線。一次96孔板實驗可以進行20-25個樣本的檢測工作。

Q:ELISA 的檢測數據如何進行處理?

A:1)將得到的各個復孔濃度的吸光度值計算平均值。

2)按照橫坐標為梯度稀釋的標準品濃度,縱坐標為吸光度值做散點圖,添加趨勢線,利用多項式回歸分析計算由以上數據產生的公式R2 值(R2 值越接近1說明線性關系越好)。

3)根據公式及待測樣本的平均吸光度值計算樣本中目的蛋白的濃度。


Q:常用的免疫學檢測方法ELISAWB的區分有哪些?


區分項目

ELISA

WB

目的

不僅可以檢測抗原還可以檢測抗體,對其進行定性和定量分析。

定性分析,對膠片灰度值進行半定量分析。

抗體識別位點

線性化或構象型位點均可。

線性化位點。

優點

96 孔板可以處理多個樣本,通過設置復孔,對照,梯度可提高數據的可信度,且靈敏度高于WB。

可明確蛋白的分子量大小,以及是否為多聚體或發生降解。

缺點

如果抗體有非特異性結合,得到的數值則不可信。

一次電泳最多處理10-20 個樣本。


參考文獻

1. J.R. Crowther. The ELISA Guidebook. Hunana Preaa,2001.

2. J.R. Crowther. ELISA:Theory and Practice.Humana Press,1995.

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