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銳賽生物

靶標發現與功能驗證基因操作和基因組編輯藥物靶標開發生化/細胞水平驗證高通量高內涵分析GPCR/核受體檢測激酶檢測體外藥理學體外安全性評價藥代動力學毒理學評價藥代動力學/毒理學抗腫瘤藥理評價代謝類和心腦血管疾病藥理評價中樞神經系統藥理評價炎癥/自身免疫疾病藥理評價體內藥理學立項成果展示腫瘤個性化治療項目QPCRWB檢測ELISA檢測甲基化檢測SNP檢測高效液相色譜法(HPLC)蛋白質譜基因芯片核酸、蛋白分析服務目的基因的ORF克隆化學合成質粒載體構建siRNA的細胞轉染及篩選技術服務shRNA載體構建及篩選技術服務RNAi病毒包裝及篩選技術服務miRNA的表達載體構建及病毒包裝載體構建及篩選服務chipchip-seqIPCO-IPRNA免疫共沉淀(RIP)RNA pull down免疫共沉淀實驗服務慢病毒包裝腺病毒包裝細胞培養原代細胞分離干細胞誘導分化CCK-8檢測流式周期檢測流式凋亡檢測流式分選細胞流式鑒定細胞表面抗體活性氧(ROS)檢測線粒體膜電位檢測transwell檢測管腔形成實驗細胞黏附實驗細胞克隆形成實驗細胞免疫熒光檢測穩轉株構建雙熒光素酶檢測細胞干性成球能力磁珠分選細胞MDA(丙二醛)檢測酶活動力學檢測HDA檢測細胞實驗服務常規化學染色免疫組化(IHC)免疫熒光(IF)原位雜交(ISH)熒光原位雜交(FISH)原位末端標記染色(TUNEL)組織樣本處理拍照處理病理學檢測服務裸鼠皮下成瘤(CDX模型)人源腫瘤移植模型(PDX模型)糖尿病/肥胖模型心血管類疾病模型腎臟疾病模型肝臟疾病模型炎癥與自身免疫疾病模型呼吸系統疾病模型其他疾病模型動物實驗服務2019精品SCI2018精品SCI2017精品SCI往年精品SCI案例庫漂亮SCI案例庫科研轉化成果u.cad癌癥篩查檢測全外顯子組基因檢測其他疾病基因檢測生物信息數據分析服務腫瘤學領域研究平臺病理學中心實驗室心血管與代謝領域疾病研究平臺炎癥與自身免疫疾病領域研究平臺特發肺纖維化疾病領域研究平臺抗體藥物一體化臨床前研發平臺藥性評價平臺公司新聞價值金字塔三元悖論為客戶贏得榮譽誠覓英才內部推薦加入我們留言板聯系我們推薦朋友SCI論文發表獎勵制度科研資助POLOdeliverer3000CCK-8Annexin V-FITCAnnexin V-RFPECL 發光液細胞周期與凋亡檢測自研試劑基因質粒病毒免費送細胞庫動物飼料促銷活動

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動物實驗、載體構建、細胞實驗、病理學檢測、免疫沉淀、核酸蛋白分析

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雙熒光素酶檢測

Luciferase assay



實驗原理


miRNA通過堿基配對結合到靶mRNA的3’UTR區,抑制靶基因的翻譯或對靶基因mRNA的降解達到調控基因表達的目的。將靶mRNA的3’UTR區構建至螢火蟲熒光素酶報告基因的3’端,與miRNA表達載體及海腎熒光素酶報告基因載體共轉染細胞,先后加入兩種底物熒光素,通過對熒光素酶報告基因的表達檢測確認miRNA對靶基因的調控效果。下圖為雙熒光素酶報告基因檢測載體的示意圖。


圖6.5 雙熒光素酶報告基因檢測系統示意圖


技術應用


通過miRNA靶標的鑒定從而進行miRNA功能的深入研究。


實驗流程




實物

數據信息

實驗周期

客戶提供

miRNA序列信息及靶點信息

10周

我們提供

質粒、菌株

基本實驗步驟、測序報告、EXCEL原始數據



實驗結果展示


圖 1 hsa-miR-9-1 的靶點篩選結果
1)四組質粒的 293 細胞共轉染后的細胞照片;2)四組細胞的雙熒光素酶報告基因檢測柱形圖。
注:WT為野生型3'UTR 區的螢火蟲熒光素酶報告基因質粒,Mut為突變型3'UTR 區的螢火蟲熒光素酶報
告基因質粒,結果表明待研究的 miRNA 對靶基因有較明顯的調控作用。


TROUBLESHOOTING

實驗問題

原因

推薦解決方法

發光檢測值過低?

熒光素酶表達多低

注意調整細胞狀態、轉染條件、轉染量,提高發光值。

檢測試劑

避免反復凍融以及保存時間過長。

發光檢測值過高?

熒光素酶表達過高

建議通過降低轉染量或減少檢測體積等降低發光。


常見問題FAQ


Q :有哪些數據庫可對miRNA的靶基因進行預測分析?

A :根據miRNA 5‘ 端2-8個核苷酸可與靶mRNA 3‘ UTR區完全互補這一特點,結合miRNA與靶基因形成二聚體的熱力學穩定性和二級結構進行分析,有如下數據庫的預測分析結果可供參考:


miRNA靶基因預測方法

檢測范圍

算法特點

miRanda


人,果繩,斑馬魚


序列匹配,雙鏈結合自由能,物種間保守性

TargetScan

/TargetScanS

人,小鼠,大鼠,狗,雞,蛙,黑猩猩,恒河猴,牛,負鼠

提出“miRNA種子區”的概念

RNAhybrid

哺乳動物

快速準確計算miRNA-mRNA二聚體自由能

DIANA-microT

人,小鼠,大鼠,果繩

考慮miRNA調控單個靶位

點的情況

PicTar

脊椎動物

區分“完全匹配種子區”與“不完全匹配種子區”

RNA22

哺乳動物

不考慮保守性,由mRNA入手預測相miRNA



Q :熒光素酶報告基因有哪些特點?有哪些應用?

A :在熒光素酶的催化下,熒光素可被氧化并釋放光子,可用熒光檢測儀對熒光定量測定。熒光素酶檢測系統具有非放射性,靈敏度高的特點。熒光素酶咋哺乳動物細胞中的半衰期為3小時,半衰期短不發生積累,故調控元件的改變會即時導致熒光素酶活性的改變,可進行快速方便的分析。我們把感興趣的基因轉錄的調控元件克隆在熒光素酶報告基因的上游或下游,構建成報告基因質粒,即可進行啟動子、增強子的活性研究,miRNA的靶點篩選工作。


Q :熒光素酶的發光波長是多少?

A :螢火蟲熒光素酶催化luciferin發光的最強發光波長為560nm。海腎熒光素酶催化coelenterazine發光的最強發光波長為465nm。


Q :熒光素酶檢測系統需要制備標準曲線嗎?

A :一般不需作標準曲線。熒光素酶檢測系統用于比較樣品的相對活性。


Q:雙熒光素酶報告基因系統有何優點?

A:在雙熒光素酶報告基因測試中,將螢火蟲熒光素酶作為實驗報告基因,海腎熒光素酶作為對照報告基因。實驗報告基因用于測試實驗條件下基因的表達,而對照報告基因作為內對照,以使實驗報告基因測試的結果歸一化。作歸一化可消除實驗過程中減弱實驗準確度的變化,如培養細胞的數量、細胞轉染及裂解的效率等。


Q:熒光素酶報告基因與GFP的區別是什么?

名稱

檢測方法

應用

特點

GFP綠色熒光蛋白

顯微鏡下直接觀察

轉染效率的檢測或融合目的蛋白,觀察蛋白表達情況

方便直觀

熒光素酶報告基因

細胞裂解后加入底物在熒光檢測儀中進行測定

研究啟動子的功能與調控


可準確定量




參考文獻

1. Lee DY, Deng Z,Wang CH, et al.MicroRNA-378 promotes cell survival, tumor growth, and angiogenesis by targetingSuFu and Fus-1 expression.PNAS 2007,(104):20350-20355.

2. Dong F, Lou D. MicroR NA-34b/c suppresses uveal melanoma cell proliferation and migration through multipletargets.Molecular Vision 2012,(18):537-546.

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